Védés megtekintése

Védés megtekintése

 
Globuláris és rendezetlen fehérjék, fehérje-membránmimetikum kölcsönhatások szerkezeti és dinamikai jellemzése NMR spektroszkópiával
Gyógyszertudományok
Dr. Szőke Éva
SE Egyetemi Gyógyszertár Gyógyszerügyi Szervezési Intézet
2022-05-11 00:00:00
A gyógyszerészeti tudományok korszerű kutatási irányai
Dr. Antal István
Dr. Bodor Andrea
Dr. Ambrus Attila egyetemi docens
Dr. Tőke Orsolya tudományos főmunkatárs
Dr. Noszál Béla professor emeritus
Dr. Mirzahosseini Arash egyetemi adjunktus
Dr. Béni Szabolcs egyetemi docens
Dr. Kövér Katalin egyetemi tanár
Doktori munkám során az NMR spektroszkópia sokrétű alkalmazásával különböző rendszerek (rendezetlen fehérjék, peptidek, globuláris fehérjék, membránmimetikumok) szerkezeti és dinamikai vizsgálatát végeztem. A rendezetlen fehérjék nagy mennyiségben tartalmaznak prolin aminosavakat, melyek oldatban transz és cisz izomerként is előfordulhatnak. A p53 TAD modellrendszeren a cisz-prolin hatására létrejött minor konformereket, illetve a prolin izomereket azonosítottam a kidolgozott, nagy érzékenységű 1Hα-detektált módszerek segítségével. A CK2 kinázzal történt foszforiláció során a p53 TAD doménjében a P47 esetén a cisz-transz egyensúly eltolódását tapasztaltuk. A rendezetlen fehérjékben jelen lévő cisz-prolin mennyisége a prolin környezetében lévő aminosavak típusától függ. Statisztikai elemzés lehetővé teszi a cisz-transz egyensúly szabályozását pontmutációk beépítésével. Az ERD14 dehidrinből és az S100A4 fehérjéből származó peptidek esetén a szerkezeti hajlamokat és fluoreszcens festék hatását vizsgáltam NMR spektroszkópiával. A peptidek rendezetlenek, a karboxifluoreszcein jelölés nem változtat jelentősen a szerkezeten, ellenben térközelbe kerül a peptid fenilalanin oldalláncához, amely hatással van a sejtpenetrációs képességére. A fenilalanint tartalmazó ERD-A, ERD-B és S100 esetén jelentős eltérés van az 5- és 6-karboxifluoreszcein tartalmú peptidek intracelluláris fluoreszcencia intenzitásában, mely az eltérő bejutási képességre utal. A peptidek UC50 értékei alapján a 6-Cf peptidek sejtbejutási képessége jobb, illetve a peptidek közt is különbség figyelhető meg, sorrend a következő: ERD-B> ERD-A>ERD-C>S100. A sejtbejutás mellett a sejten belüli lokalizáció is eltér. A bejutás mechanizmusa a gátlószerekkel végzett kísérletek alapján endocitózis és makropinocitózis. A dolgozatomban vizsgált SGPI-2 és SPINK1 vázú szerin proteáz inhibitorok esetén a Laskowski-modell által feltételezett vázfüggetlenség nem teljesül. A két váz során eltérő hurokszekvencia az ideális, továbbá a hurokcsere jelentősen csökkenti a kimotripszinhez az affinitást. A kevésbé stabil SGPI-2 esetén a hurokcsere megváltoztatja az inhibitorváz szerkezetét. A 3. β-szál rendezetlenné válik, amely előnytelen az enzimkötődés létrejöttéhez. A stabil SPINK1 váz a hurokcsere esetén nem mutat szerkezeti változást, ellenben a hurokrégió torzul, amely jelentős affinitásvesztést okoz.