Phosphorylation-dependent regulation of the Rac-specific GTPase activating protein ARHGAP25
Wisniewski Éva
Szentágothai János Idegtudományok
Dr. Bereczki Dániel
SE Élettani Intézet könyvtára
2023-09-27 15:00:00
Celluláris és molekuláris élettan
Dr. Hunyady László
Ligeti Erzsébet, Dr. Csépányi-Kömi Roland
Dr. Bőgel Gábor
Dr. Gombos Imre
Dr. Sőti Csaba János
Dr. Pomozi Viola
Dr. Tóth József
A Rho családba tartozó ciklikus működésű kis G-fehérjék, úgymint Rho, Rac és Cdc42 az aktin-citoszkeleton rendszer szabályozásán keresztül olyan fontos sejtműködésekben vesznek részt, mint az adhézió, migráció és az immunsejtek effektor válaszai. A GTPáz aktiváló proteinek, más néven GAP-ok képesek a kis G-fehérjék lassú, endogén GTP hidrolízisét fokozni, ezzel elősegítve az inaktív, GDP-t kötött állapot létrejöttét. Munkacsoportunk elsőként írta le a Rac-specifikus ARHGAP25 szabályozó szerepét a neutrofil granulociták fagocitózisában, szuperoxid-termelésében és endotélen keresztüli vándorlásában. Az utóbbi években megszaporodott azon tanulmányok száma is, melyek az ARHGAP25 jelentőségét mutatták ki különböző, nem hemopoetikus sejt-eredetű daganatok kialakulásában és metasztázisában. Ez utóbbi még időszerűbbé teszi az ARHGAP25 (poszt-transzlációs) szabályozásának kutatását, melyről eddig kevés ismerettel rendelkezünk.
Ph.D. munkám során az ARHGAP25 foszforilációját vizsgáltam, valamint ennek hatását a fehérje enzimatikus működésére. Adatbázisok segítségével és tömegspektrometriai analízissel tizenegy foszforilációs helyet azonosítottunk az ARHGAP25 szerkezetén belül. Kollaborációs partnerünkkel megállapítottuk, hogy a 363. pozícióban levő szerin foszforilációja jelentős szerepet tölt be egerekben a hemopoetikus ős- és progenitor sejtek (HPSC) csontvelőből történő kivándorlásában. A jelenleg elérhető, az in vitro GAP aktivitás mérésére szolgáló módszerek korlátai és hátrányai miatt kifejlesztettünk egy biolumineszcencia rezonancia energia transzfer (BRET) alapú módszert, mely a Rac és az őt aktív állapotban kötő CRIB domén kölcsönhatásán alapul. Igazoltuk, hogy módszerünk összemérhető más GAP próbákkal, és ezen felül költséghatékony, biztonságos (nincs szükség izotópra), kiváló időbeli felbontást nyújt, és nagy elemszámú minta vizsgálható vele. Kimutattuk, hogy a neutrofil granulociták citoszoljában található kinázok képesek foszforilálni az ARHGAP25-öt, és ezen foszforiláció gátolja a GAP aktivitást. Végül foszforilációra képtelen (szerin-alanin) mutánsok segítségével bizonyítottuk, hogy a GAP aktivitás gátlásában a 363. és 488. pozícióban levő szerinek foszforilációja jelentős szerepet játszik, míg a 379-380. szerinek foszforilációja nincs hatással az ARHGAP25 enzimaktivitására.
