A humán NADPH-oxidáz 5 (NOX5) enzim vizsgálata új monoklonális antitesttel
Szeles Zsolt
Molekuláris Orvostudományok
Dr. Enyedi Péter
Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományi Központ Hári Pál Előadóterem
2024-07-03 11:00:00
Dr. Geiszt Miklós, Dr. Petheő Gábor
Dr. Wunderlich Lívius
Dr. Szöllősi András
Dr. Fekete Andrea
Dr. Gál Anikó
Dr. Szeri Flóra
A NADPH-oxidázok családjában a NOX5-ről tudunk a legkevesebbet. Ismerjük az enzim megoszlását az emberi szervezetben, elsősorban a lépben és a herében fordul elő. Azonban a NOX5 fehérjeszintű detektálásához korábban nem állt rendelkezésre széles körben hozzáférhető, megfelelő minőségű antitest. Ezért kifejlesztettünk egy új, monoklonális, humán NOX5-öt felismerő antitestet, együttműködve az Immunogenes Kft-vel, és elvégeztük annak részletes jellemzését is. Az antitest immár kereskedelmi forgalomban is elérhető. Bízunk benne, hogy az általunk kifejlesztett antitest új lendületet ad a NOX5 elhelyezkedését és funkcióját vizsgáló kutatásoknak.
Létrehoztunk egy NOX5-öt stabilan expresszáló HEK293T sejtvonalat. A túltermeltetett fehérjét intracellulárisan döntően az endoplazmatikus retikulumban és a sejtmagmembránban láttuk. Szuperoxidmérésekkel igazoltuk, hogy a sejtek funkcióképes és kalciummal aktiválható enzimet fejeznek ki. Az endogén NOX5 tanulmányozására az UACC-257 melanóma sejtvonalat használtuk. Western blot és immunfestési eljárásokkal, NOX5 siRNS-sel kontrollált kísérletekben igazoltuk, hogy a kifejlesztett antitest felismeri az endogén NOX5 fehérjét. Az enzim ezen sejtekben is főként a fentebb említett kompartmentekben oszlik szét. Kalciumra átjárható TRPV4 csatorna aktivációjával (GSK1016790A) és a SERCA gátlásával (thapsigargin) kiváltottunk a sejtekben kalcium jelet, amit szuperoxidtermelés követett. A NOX-okat gátló DPI és NOX5 siRNS segítségével igazoltuk, hogy a mért ROS NOX5 eredetű.
Az új monoklonális antitesttel kimutattuk a NOX5 fehérjét normál, humán lépben, herében és petefészekben Western blot és immunhisztokémiai technikákkal. RNS adatbázisok elemzésével azonosítottuk az oxidáz celluláris forrásait a nevezett szövetekben, alátámasztva ezzel immunfestési eredményeinket. Herében a korai és kései spermatidák, petefészekben az oocyták és granulosa sejtek, a lépben pedig az endotélsejtek az enzim fő kifejeződési helyei. A szakirodalommal ellentétben, de összhangban a mRNS adatbázisokkal, a lép endotél kivételével primer vaszkuláris sejtekben nem találtunk érdemi NOX5 kifejeződést.
Elvégeztük a laboratóriumunk által létrehozott NOX5 hiányos nyulak „off-target” analízisét egyéb NADPH-oxidázokra. Megállapítottuk, hogy a CRISPR/Cas9 technikával létrehozott nyulakban nem sérültek a NOX1, NOX2 és NOX4 gének a módosítás hatására.
